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"Combined effects of melatonin and all-trans retinoic acid and somatostatin on breast cancer cell proliferation and death: molecular basis for the anticancer effect of these molecules"

September 5, 2012 at 22:26


Sul numero del 15 Aprile 2012 dell’European Journal of Pharmacology è stato pubblicato lo studio scientifico dal titolo "Combined effects of melatonin and all-trans retinoic acid and somatostatin on breast cancer cell proliferation and death: molecular basis for the anticancer effect of these molecules", condotto presso il dipartimento di anatomia, istologia e medicina legale dell’Università di Firenze, ad opera di Martina Margheri, Nicola Pacini, Alessia Tani, Daniele Nosi, Roberta Squecco, Aida Dama, Erico Masala, Fabio Francini, Sandra Zecchi-Orlandini e Lucia Formigli.

Negli ultimi 30 anni si è molto discusso a proposito delle possibili relazioni fra la 5-metossi-N-acetiltriptamina o melatonina (MLT) ed il carcinoma mammario estrogeno sensibile. Le prime ricerche focalizzarono l'attenzione sul ruolo svolto dalla MLT in modo indiretto quale fisiologico agente regolatore della secrezione ovarica di estrogeni (Cohen et al. 1978). Successivamente fu evidenziato come il tasso notturno di MLT in donne affette da cancro al seno estrogeno sensibile fosse notevolmente ridotto rispetto a donne sane (Tamarkin et al. 1982).

Sebbene la sintesi della MLT a partire dalla serotonina sia possibile in vari organi ed apparati, quale possibile fattore autocrino/paracrino indipendentemente dal fotoperiodo (Kvetnoy, 1999; Morera & Abreu, 2005; Reiter & Tan, 2003), il picco plasmatico di MLT, correlato ad un'attività endocrina propriamente detta, si mostra durante le ore notturne ad opera dalla ghiandola pineale, o epifisi, in funzione del fotoperiodo. Sulla base di questa considerazione fu successivamente segnalata una ridotta incidenza di cancro al seno in donne non vedenti (Coleman & Reiter, 1992; Feychting et al. 1998; Kliukiene et al. 2001) ed al contrario una maggiore incidenza di cancro al seno in gruppi di lavoratrici notturne esposte per molte ore ad eccessiva illuminazione (Kheifets & Matkin, 1999). Questi studi di carattere epidemiologico, se da un lato suggeriscono una stretta relazione tra tasso plasmatico di MLT ed eziopatogenesi del carcinoma mammario estrogeno sensibile, dall'altro esprimono poco a proposito dei meccanismi attraverso cui tale relazione si realizza.

A fianco degli studi epidemiologici, ricerche in vitro, in particolare sulla linea MCF-7 di carcinoma mammario metastatico estrogeno sensibile, hanno suggerito un’azione della MLT nel contrastare l'azione proliferativa degli estrogeni. Sebbene alcuni studi abbiano indicato un possibile ruolo della MLT nell’induzione dell’apoptosi, recenti studi hanno sottolineato che la MLT non agirebbe quale induttore di apoptosi ma più semplicemente come inibitore della proliferazione (Cos et al. 2002), rallentando l'attività mitotica e la transizione dalla fase G0/G1 e G1/S (Cos et al. 1996). È stato inoltre evidenziato che tali azioni della MLT si manifestano attraverso il recettore MEL-1, espresso in questa linea cellulare (Ram et al. 1998). A riprova di ciò, la propria overespressione aumenta l'effetto citostatico/oncostatico della MLT (Yuan et al. 2002). Tale azione potrebbe essere il risultato di una forte diminuzione dei livelli di cAMP, il quale condurrebbe ad un’inibizione dell'espressione del recettore per gli estrogeni ERα.

Da molti anni è oramai nota l'azione antiproliferativa e prodifferenziante dell'acido all-trans-retinoico (ATRA), sia in vari tessuti epiteliali sani che in tessuti di origine neoplastica, ed in particolare nel carcinoma mammario ER+. Questa molecola ed i suoi analoghi di sintesi sono stati utilizzati con risultati talora interessanti, talora discordanti, in programmi di chemioprevenzione (Howe, 2007).

Le molteplici azioni dell’ATRA si realizzano attraverso il legame con vari recettori nucleari, quali i recettori RAR, e nel caso del derivato acido 9-cis-retinoico attraverso i recettori nucleari RXR. In cellule MCF-7 si è potuto evidenziare che il trattamento sequenziale con MLT e successivamente ATRA conduce ad un significativo arresto della proliferazione sotto l'azione di vari fattori di crescita tra cui l'insulina, segnalando in queste condizioni anche un effetto citostatico/citotossico dovuto ad apoptosi (Eck et al. 1998). Sebbene sia stata documentata una sottoespressione dei recettori nucleari RAR beta, associata a resistenza all'ATRA, è stato inoltre attestato il silenziamento genico dell'espressione dell'isoforma recettoriale di RAR alfa2 dell'ATRA ad opera di meccanismi epigenetici coinvolgenti ipermetilazione (Farias et al. 2002). L’importanza di questa isoforma recettoriale dei recettori RAR dell'ATRA è stata poi ben documentata anche in molte altre neoplasie ed in svariati processi di differenziazione cellulare, sia in vitro che in vivo (Sano et al. 2003; Walkley et al. 2004).

Infine, da diversi anni sono state effettuate varie ricerche sulla somatostatina (SST) quale possibile agente oncostatico (Kleinberg et al. 2009). Parte delle proprie potenziali azioni in vivo risiedono nel blocco della secrezione di GH, e conseguentemente di IGF-1. Nel caso del carcinoma mammario, vari studi in modelli animali hanno evidenziato l'importanza di GH/IGF-1 per la progressione e lo sviluppo del tessuto neoplastico (Foekens et al. 1989). Ricerche in vitro ed in vivo sull'asse GH/IGF-1 hanno rilevato la presenza di specifici recettori cellulari per la SST appartenenti ai GPCR, sia in tessuti normali che neoplastici, tanto che ligandi somatostatinergici vengono utilizzati in procedure di imaging a scopo diagnostico (Mankoff et al. 2008). Nonostante inizialmente si ritenesse che i recettori per la SST fossero espressi solo in tessuti di natura neuroendocrina ed appartenenti al sistema APUD, sia tumorali che non, è stata successivamente segnalata la loro espressione in tessuti sani e tumorali, anche di natura non neuroendocrina (Smitha et al. 2004).

Nel modello in vitro delle cellule MCF-7 è stata rilevata la presenza di recettori della SST, ed un’azione inibitoria della SST sulla crescita e lo sviluppo di queste cellule. In particolare, anche in questo caso è stata documentata una latenza maggiore del ciclo cellulare e della transizione G1/S (Setyono-Han et al. 1987). Recentemente, in cellule MCF-7 è stata rilevata la omo- ed eterodimerizzazione dei recettori della SST ed in particolare l'omodimerizzazione del sottotipo SST-1 e SST-5, la quale dimerizzazione sembra essere innescata dal fattore di crescita epidermiode (EGF), ed appare modulare e conseguentemente contrastare l'azione dei recettori dell’EGF in questa linea cellulare ed in altre neoplasie (Watt et al. 2009). Altri studi mostrano inoltre un’azione antiproliferativa diretta ad opera dell’attivazione del recettore SST2 in cellule MCF-7 (He et al. 2009). L'overespressione di tale recettore incrementerebbe notevolmente l'azione oncostatica della SST. Il proprio principale meccanismo d'azione diretto, non mediato dall'IGF-1, potrebbe essere riferito alla riduzione dell'espressione dei recettori per l’EGF, l’attivazione di varie fosfatasi, nonché un’interferenza sulla colocalizzazione del recettore per l'EGF.

Uno degli scopi del presente lavoro sperimentale è stato quello di valutare da un punto di vista quali-quantitativo la vitalità, la proliferazione e la morfologia di cellule MCF-7 trattate con dosaggi farmacologici di MLT nel breve periodo di 24, 48 e 72 ore, in assenza di estrogeni, così da segnalare eventuali fenomeni non connessi con la pathway di segnalazione degli estrogeni.

Basandosi su precedenti osservazioni riguardanti gli effetti antitumorali della MLT sul cancro al seno (Cos & Sánchez-Barceló, 2000; Grant et al. 2009; Subramanian & Kothari, 1991), questa ricerca ha fornito evidenze sperimentali che i propri effetti risultano fortemente potenziati quando la molecola è utilizzata in combinazione con ATRA e SST. Il trattamento con MLT, ed in  particolare, l'approccio combinato di MLT, ATRA e SST mostra riduzione della proliferazione cellulare e l’induzione della necrosi cellulare.

Le seguenti immagini ottenute al microscopio elettronico a trasmissione mostrano:


Cellule MCF-7 non trattate (CTRL).

 
Cellule MCF-7 trattate con MLT.

 
Cellule MCF-7 trattate con l’associazione di MLT, ATRA e SST.

È possibile notare come la MLT, e specialmente l’associazione con ATRA e SST, sia in grado di indurre rigonfiamento cellulare e rarefazione citoplasmatica, indicativi del fenomeno di necrosi.


Cellule MCF-7 trattate con tamoxifene.

Il tamoxifene promuove modificazioni morfologiche associate ad apoptosi, quali emarginazione e frammentazione della cromatina.

Sebbene la MLT sia stata molto studiata quale possibile agente oncostatico, soltanto due lavori hanno valutato la propria azione sull'espressione della ciclina A: il primo è uno studio su una linea di trofoblasti maligni (Shiu et al. 2000), ed il secondo uno studio su cellule tumorali della prostata trapiantate in topi atimici (Xi et al. 2001). In entrambe le ricerche la MLT ha portato ad una marcata riduzione dell'espressione della ciclina A con arresto della proliferazione cellulare.

Anche in questo studio, grazie all’utilizzo di tecniche di immunofluorescenza e microscopia confocale, si è riscontrata una riduzione dell'espressione di ciclina A, quale indicatore di proliferazione cellulare, sia con il trattamento con MLT 100 μM che, soprattutto, con l’associazione di MLT 100 μM ad ATRA 1 μM e SST 1 μM.

Invece, a tutt'oggi nessuno studio è stato dedicato alla possibile azione da parte della MLT sull'espressione e sull’attività dei recettori Notch.

La Notch signaling pathway è un meccanismo conservato evolutivamente che controlla una vasta gamma di processi cellulari, inclusi il differenziamento, la proliferazione e l'apoptosi. I segnali trasdotti dai recettori Notch controllano risposte della cellula a stimoli intrinseci ed estrinseci, necessitando del contatto tra due cellule adiacenti. Alterazioni nei livelli di espressione della Notch signaling pathway sono state riscontrate in vari tumori umani ed in particolare nelle neoplasie mammarie sia ER+ che ER- (Guo et al. 2011; Miele et al. 2006). Alti livelli di espressione di Notch-1, e del suo ligando Jagged-1, risultano correlati al tasso di crescita tumorale e rappresentano un indicatore prognostico indipendente (Dickson et al. 2007; Reedijk et al. 2005).

La comunità scientifica sta attualmente accumulando una notevole letteratura a proposito della via di segnalazione di Notch: essendo questa pathway essenziale e specifica, ed implicata in numerose neoplasie fra cui quelle a carico del sistema immuno-ematopoietico, nel cancro mammario, nelle neoplasie polmonari, pancreatiche ed in molte altre, si comprende come una delle sfide maggiormente sentite dalla ricerca odierna sia proprio ritrovare molecole che possano inibire la via di Notch.

Nel presente studio è stato rilevato che il trattamento con MLT, ed in particolare il trattamento della sostanza in associazione ad ATRA e SST, è in grado di ridurre significativamente l'espressione di Notch-1 a livello sia proteico che di mRNA, e contemporaneamente di influenzare la propria attivazione e migrazione nucleare, suggerendo che la via mediata da Notch-1 possa essere un obiettivo primario dell’azione antiproliferativa di queste molecole. Questa ipotesi è stata ulteriormente supportata dalla dimostrazione che i livelli di espressione di Hes1, importante bersaglio a valle di Notch ed appartenente alla famiglia Hes di repressori trascrizionali (Mittal et al. 2009), risultano fortemente ridotti nelle cellule trattate rispetto ai controlli.

Questa constatazione rappresenta una novità sul piano della biologia molecolare della MLT. La considerazione di questo dato supera di importanza la semplice precedente dimostrazione di morte cellulare, ovvero del semplice fenomeno epimanifesto, in quanto indica che la MLT può ridurre l’espressione di un fattore essenziale in grado di interessare anche le cellule staminali tumorali.

Un altro aspetto interessante è che la Notch signaling pathway riveste particolare importanza nella sintesi di proteine mitocondriali e nell’attività dei mitocondri. Mediante la stimolazione della AKT signaling pathway, i recettori Notch favoriscono la sintesi di proteine che, stabilizzando la membrana mitocondriale, eludono la via intrinseca dell’apoptosi ed il rilascio di citocromo C.

Negli ultimi anni numerose acquisizioni hanno sottolineato un ruolo fondamentale dei fenomeni elettrofisiologici sulla crescita e sulla proliferazione di varie neoplasie. In particolare, a proposito di cellule MCF-7 è stato rilevato che l'espressione e la funzionalità di canali del potassio rettificanti in uscita (outward current) di tipo hEAG sono associate alla proliferazione ed all’acquisizione di caratteri predisponenti alla metastatizzazione. A riprova di ciò è stato anche espresso che il TEA, un noto agente bloccante di tali canali, diminuisce l'incorporazione della timidina triziata ed il grado di proliferazione di queste cellule. L’eventuale azione della MLT sui fenomeni elettrogenici di membrana in relazione alla proliferazione di cellule MCF-7 non era stata finora indagata da nessun autore. Nello studio si è proceduto ad una valutazione degli eventuali fenomeni elettrofisiologici mediante l’utilizzo della tecnica del whole cell pacth clamp.

Anche in questa parte del lavoro è stato evidenziato che la molecola maggiormente attiva è la MLT, sebbene già si conoscesse come questa molecola risulti attiva nei confronti delle correnti del potassio (Xx Xxxxx L et al. 2002; Rich A et al. 1999).

Sono state individuate varie correnti del K+ in uscita (delayed rectifier):
--- una corrente che si attiva rapidamente, IKr, la quale si inattiva lentamente e satura a potenziali positivi.
--- una corrente che si attiva lentamente, IKs.
--- una corrente che si attiva velocemente e che non si inattiva, IKv.

Siccome queste correnti vengono bloccate dal TEA è stato ragionevolmente dedotto che si tratti di correnti del K+. L’ampiezza di IKr e IKs non varia nel tempo, mentre quella di IKv aumenta progressivamente dalle 24 alle 72 ore di coltura. La principale corrente del K+ è risultata IKr, dato che la sua ampiezza a 24 ore è da 2 a 5 volte maggiore rispetto a quelle di IKs e IKv, ed a 72 ore è circa 2 volte maggiore. Queste tre correnti differiscono per il voltaggio della soglia di attivazione, la quale mostra potenziali più negativi per IKv rispetto a IKs e IKr (rispettivamente -40, -30 e -20 mV).

Le proprietà delle correnti del K+, come la soglia di attivazione, la voltaggio dipendenza, l’ampiezza e la cinetica sono risultate essere influenzate diversamente a seconda del trattamento: nelle cellule trattate con MTL l’ampiezza di IKr è fortemente ridotta, mentre l’ampiezza di IKs è significativamente aumentata, quella di IKv non aumenta come nelle cellule tumorali ma mantiene un’ampiezza simile rispetto ai controlli dopo 24 ore. Gli effetti del trattamento con MTL, ATRA e SST su IKr risultano simili a quelli del trattamento con MLT, ma aumentati di circa 3 volte nell’ampiezza di IKs e ridotti fortemente o annullati nell’ampiezza di IKv. Il cambiamento di queste correnti può chiarire il grande stato di depolarizzazione delle cellule trattate ed il manifestarsi del fenomeno di necrosi. Si mostra perciò che la veloce e bassa soglia di attivazione di IKv, che può essere attivata a potenziali di riposo depolarizzati di MCF-7, è meno funzionale o meno espressa nelle cellule trattate. Per questo motivo esse risultano meno capaci di mantenere il potenziale di riposo, rivelandosi pertanto maggiormente depolarizzate.

È stato inoltre valutato il numero delle cellule non responsive alla stimolazione elettrica: tutte le cellule di controllo risultano responsive, mentre le cellule trattate con MTL, ATRA e SST appaiono non responsive, non mostrando correnti del K+ o correnti limitate poco sopra al rumore di fondo. Infine, le correnti del K+ in cellule trattate con tamoxifene, in grado di indurre morte cellulare per apoptosi, risultano fortemente ridotta, mentre le cellule non responsive rappresentano circa il 70%.

Questo insieme di dati elettrofisiologici suggerisce la complessità d’azione di queste molecole e propone, specie per la MLT, un proprio peculiare meccanismo d’azione.

Lo studio dei meccanismi d’azione di MLT, SST ed ATRA, tre delle principali sostanze utilizzate nella cura biologica adottata dal Prof. Xx Xxxxx, è stato condotto al fine di evidenziare una possibile sinergia in termini di morte cellulare, effetto antiproliferativo, riduzione dell'espressione della ciclina A e del recettore Notch, e cambiamenti nell'attività dei flussi ionici transmembranari. Si è desiderato in definitiva valutare l'attività di un insieme di sostanze che, seppur con modalità e meccanismi biomolecolari tra loro differenti, potrebbero concorrere alla regolazione della crescita e del differenziamento di questo modello cellulare.

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